Linkam CMS196V³ Cooling Stage for Cryo-Correlative Microscopy

Die CMS196 wurde in Zusammenarbeit mit dem Team von Prof. Bram Koster am Leiden University Medical Centre (LUMC) in den Niederlanden entwickelt. Es ist das Ergebnis von vier Jahren Forschung und Entwicklung.    

„Die korrelative Stage wurde aus der Notwendigkeit heraus geboren, ein Werkzeug zu entwickeln, das die Fluoreszenzmikroskopie nutzt, um interessante Strukturen in Proben für hochauflösende kryo-elektronenmikroskopische Aufnahmen zu lokalisieren. Im Laufe der Jahre hat sich das System zu einem effektiven und effizienten Instrument entwickelt, das die routinemäßige Aufnahme von kryo-elektronenmikroskopischen Bildern nach lichtmikroskopischer Charakterisierung ermöglicht.“   
Prof. A.J. Koster - LUMC 
 

CMS196V³ Kryo-CLEM Tisch - Überblick 

Der CMS196V³ Kühltisch ist ein Kryo-CLEM-Instrument, das den gesamten Arbeitsablauf der CLEM (Correlative Light and Electron Microscopy) ermöglicht. Neben der Aufrechterhaltung der Verglasung der Probe durch Flüssigstickstoffkühlung bietet es bewährte Funktionen für die sichere Handhabung und den Transfer von Kryoproben und deren Abbildung mit optischer Mikroskopie, wobei die Proben jederzeit frei von Kontaminationen bleiben. Der integrierte motorisierte, kodierte Tisch des neuesten Modells ermöglicht zusammen mit der neuen LINK-Software die schnelle und einfache Erstellung von hochauflösenden Karten des Gitters. Dies ermöglicht eine einfache Methode der Koordinatenzuordnung, die erforderlich ist, um dieselbe Probe sowohl im Fluoreszenzmikroskop als auch in der EM zu lokalisieren.

Der CMS196V³ wurde speziell entwickelt, um das Problem des Transfers von vitrifizierten EM-Proben-Grids von einem Fluoreszenzmikroskop zu einem Cryo-TEM ohne Devitrifikation und Kontamination durch Kondensation zu überwinden. Der Tisch musste jedoch auch optisch optimiert werden, um die Verwendung von Objektiven mit hoher NA zu ermöglichen.  

Es werden bis zu 3 Grids in eine speziell konstruierte Kassette geladen, die in einem kleinen versiegelten Behälter aus einem Plunge Freezer heraus befördert wird.  Der Behälter wird in eine vorgekühlte, trockene Probenladekammer geladen, die an einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop angebracht ist.  Die Kassette wird dann mit Hilfe spezieller Werkzeuge einfach auf die Beobachtungsplattform gesetzt. 

CMS196V³ Cryo-CLEM Stage - Merkmale / Highlights des CMS196V³ 

• Eigenständiges System zur Beobachtung von Kryoproben, das die Probe bei konstanten -196°C vitrifiziert und Kontaminationen vermeidet  
  
• Automatisches Nachfüllen von Flüssigstickstoff in die Kammer  
  
• Kurze Einschaltzeit von nur 10 Minuten, keine mechanische Verbindung zwischen Probenhalterung und Dewar, sehr gute Stabilität, geringe Drift im nm-Bereich, gute Langzeitstabilität  
  
• Integrierter motorisierter XY-Tisch mit optischen Encodern für hochpräzise Bewegung und Positionsablesung von besser als 1µm  
  
• Vollautomatisches XY Mapping  
  
• Befestigungsmöglichkeit für die meisten aufrechten Forschungsmikroskope aller großen Hersteller 
• Selbstausrichtendes magnetisches Probenkassettensystem für bis zu drei Probenraster  
  
• Unterstützung von EM-Gittern, Auto-Grids (FEI), Membranträgern (Leica HPM100), Bessy-Gittern, Planchetten, CryoCapsule von CryoCapCell und kundenspezifischen Probenhaltern, kein Umgang mit bloßen Gittern erforderlich  
  
• Probenkassettenhalter für sicheres und kontaminationsfreies Laden, Lagern und Übertragen von Proben  
  
• Anschluss an Probenvorbereitungsprotokolle für Eintauch- und Hochdruckgefrierverfahren  
  
• Integrierte Sensoren zur Überwachung der Probentemperatur  
  
• Integrierte Kondensor-Optik für Durchlicht-Hellfeld und Phasenkontrast  
  
• Fluoreszenzbeobachtung mit einer NA von bis zu 0,9  
  
• Ganztägiger, unabhängiger Betrieb mit optionalem, automatisch befüllbarem 3-Liter-LN2-Dewar  
  
• LCD-Display mit Tastensteuerung, Stand alone-Joystick-Bedienung und vollständiger Software-Steuerung über USB Schnittstelle 
  
• Automatischer Heiz- und Ausheizzyklus zum Austreiben der Feuchtigkeit  
  
• Mit über 100 Systemen, die weltweit im Einsatz sind, ist das CMS196 der bewährte Marktführer im Bereich Cryo-CLEM  

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Warum Cryo-CLEM?

Die Elektronenmikroskopie (EM) liefert Strukturinformationen mit sehr hoher Auflösung. Allerdings kann sie aufgrund von Einschränkungen bei der Färbung und Probenvorbereitung nur einen begrenzten Einblick in biologische und chemische Prozesse geben. Die Fluoreszenzmikroskopie hingegen ist eine sehr empfindliche Methode zum Nachweis biologischer, chemischer und genetischer Prozesse und Ereignisse im Inneren lebender Zellen. 
 
Cryo-CLEM bringt alles zusammen: Es ist eine neue und aufstrebende Technik, die die individuellen Vorteile der Fluoreszenz- und der EM-Mikroskopie kombiniert, das heißt, sie bildet dieselbe Probenstelle mit beiden Techniken ab und überlagert die sich ergänzenden Informationen. 
 
„Wir verwenden die Kryo-Korrelationsstufe, um Zellen zu untersuchen, die in einer dünnen Eisschicht eingeschlossen sind, bevor wir die Proben an Synchrotrons in Oxford, Barcelona und Berlin abbilden. Das Team von Linkam Scientific hat dazu beigetragen, unsere Forschung voranzutreiben, indem es die Technologie schnell angepasst und verfeinert hat, um einen eleganten, flexiblen und benutzerfreundlichen Tisch zu liefern.“   
Dr. Lucy Collinson - Leiterin der Elektronenmikroskopie, The Francis Crick Ins 
 
Abbildung von vitrifizierten Proben unter Kryobedingungen  
Um eine biologische Probe für die in der EM üblichen Vakuumbedingungen kompatibel zu machen und ihre strukturellen Details zu erhalten, werden die Proben in „glasartiges“ Eis eingebettet und müssen unter -140 °C gehalten werden. Jeglicher Kontakt mit der in der Luft enthaltenen Feuchtigkeit muss vermieden werden, da sich sofort Eiskristalle bilden, die die Probe kontaminieren und zerstören würden. Unter Kryobedingungen bleiben strukturelle Details auch unter dem Fluoreszenzmikroskop erhalten und das Photobleaching wird deutlich reduziert.  

 
Lesen Sie mehr über das neue Linkam CryoGenium Eintauchgefriersystem (in Entwicklung).